RNA purifying and gene expression analysis from fresh and frozen bovine blastocyst embryos
Laen...
Kuupäev
2012
Kättesaadavus
ainult raamatukogus, only in library
Autorid
Ajakirja pealkiri
Ajakirja ISSN
Köite pealkiri
Kirjastaja
Abstrakt
In recent decades technological developments have opened up new possibilities for genomic
research. Mouse and bovine embryos are widely used as a tool for biomedical research. These
embryos represent mammal eukaryotic cells, which have different mechanisms for gene
expression control compared with prokaryotic cells. Recent research has focused on studies of
pluripotency-associated genes and their expression levels in embryos. For mammal embryos,
gene expression profiling might give us a better tool to evaluate developmental potential. So far,
most of these studies have shown controversial results.
A recent study conducted by Suzuki Jr et al. (2009) shows that pregnancy rates in day 40 differ
depending on which method was used to produce embryos. Artificial insemination (AI) leads to
75 % pregnancy rate in day 40, whereas the same proportion for in vitro fertilization (IVF) is 50
% and for somatic cell nuclear transfer (SCNT) -- 30 %. Interestingly, blastocyst development
rate in IVF embryos is 34 % and in SCNT embryos 28 %. During 33 days, the 6-unit difference
in blastocyst formation rate increases up to a 20-unit difference in day 40 pregnancy rate
between IVF and SCNT embryos. This indicates that reprogramming of SCNT embryos and in
vitro conditions play a huge role in embryo survival rates. By comparing the gene expression
profiles between in vivo, in vitro and SCNT we can observe how changes in in vitro conditions
affect the developmental potential of embryos.
In this study, we purified ribonucleic acid (RNA) from bovine embryo pools and analysed
expression levels for gene insulin-like growth factor 1 (IGF1), insulin-like growth factor 2
(IGF2) and insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6). Embryos were either frozen
or fresh, and produced by either IVF or SCNT. RNA was purified by using the Qiagen RNeasy
Plus Micro kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). After purification the RNA was analysed
using the Agilent 2100 Bioanalyzer with RNA 6000 Pico kit (Agilent Technologies Inc.,
California, USA).
Complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) was synthesized from RNA by using the
Quantitect Reverse Transcription kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA was used as a
template for TaqMan quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis in
the ABI Prism 7900HT sequence detection system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). 9
The results of RNA analysis showed that the quality of RNA was acceptable in all samples.
Messenger RNA (mRNA) level for IGF1 was below the detection limit. IGF2 expression level
was detected in three samples. IGFBP6 mRNA level was detectable in all samples.
In addition to practical skills, the author's theoretical knowledge of modern reproductive
technologies improved notably during the experiments. These were the first experiments
conducted in our laboratory in which RNA was purified and gene expression profiles from
bovine blastocyst stage embryos were analysed. This is important, because in the future it will be
easier to undertake research in this area due to applying the methods which have proven to be
successful.
Viimaste aastate jooksul on loomade genoomiuuringud hoogustunud peamiselt geenitehnoloogia tehniliste võimaluste kiire arengu tõttu. Hiire ja veise embrüod on biomeditsiinilistes uuringutes laialdast kasutust leidnud, aidates selgitada embrüonaalse arengu geneetilisi kontrollmehhanisme. Imetajate rakkudel on võrreldes prokarüootse rakuga mitmeid erinevaid võimalusi geeniekspressiooni kontollimiseks. Viimaste aastate uuringud on keskendunud rakkude pluripotentsusega seotud geenide uurimisele. See on vajalik, kuna nimetatud geenidel on tähtis roll imetajate varajases arengus, samuti võivad nende uuringute tulemused oluliselt mõjutada embrüonaalsete tüvirakkude alaseid uuringuid. Hiljuti avaldatud uurimustöös (Suzuki Jr et al., 2009) selgus, et sõltuvalt veise embrüo tootmise tehnoloogiast, on loomade tiinestumine erinev. Leiti, et kunstliku seemenduse (artificial insemination, AI) puhul oli 40. päeval pärast seemendust 75% veistest tiined. Samas oli tiinestumine katseklaasi viljastamise (in vitro fertilization, IVF) puhul 50% ja somaatilise raku tuuma siirdamisel (somatic cell nucleus transfer, SCNT) ainult 30%. Eelnev viitab sellele, et embrüo varajases arengus on embrüote in vitro kasvutingimustel ja kloonitud embrüote reprogrammeerimise edukusel väga oluline roll. Võrreldes geeniekspressiooni profiile in vivo, in vitro ning SCNT embrüote vahel on näha, kuidas in vitro tingimuste muutmine mõjutab embrüo arengupotentsiaali. Käesoleva uuringu käigus eraldasime blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest ribonukleiinhappe (RNA) ning uurisime insuliinilaadset kasvufaktorit 1 (IGF1), insuliinilaadset kasvufaktorit 2 (IGF2) ning insuliinilaadse kasvufaktori siduva proteiini 6 (IGFBP6) kodeerivate geenide ekspressiooni. Embrüod saadi kas IVF või SCNT teel ja analüüsiti kolmest kuni kolmeteistkümnest embrüost koosnevate rühmadena. RNA eraldati embrüotest kasutades Qiagen RNeasy Plus Micro kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). Saadud RNA kvaliteeti analüüsiti kasutades Agilent 2100 Bioanalyzer’it ja RNA 6000 Pico kiipi (Agilent Technologies Inc., California, USA). Komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti kogu RNA-st kasutades Quantitect Reverse Transcription kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA puhul kasutati geeniekspressiooni modelleerimiseks Taqman kvantitatiivse reaalaja polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) meetodil ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) abil. RNA kvaliteedi analüüsi tulemused näitasid, et kõikide proovide RNA kvaliteet oli rahuldav. IGF1 ekspressiooni tuvastada ei õnnestunud. IGF2 puhul oli ekspressiooni tase piiripealne ning seda õnnestus tuvastada neljas proovis seitsmest. IGFBP6 puhul oli mRNA tase tuvastatav kõikide proovide puhul. Tegemist oli embrüolabori esimeste katsetega, kus blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest eraldati RNA ning analüüsiti geeniekspressiooni profiile. Käesolev uurimistöö aitas kaasa vastava metoodika väljatöötamisele. Lisaks praktilisele töö osale tuleb märkida autori teoreetiliste teadmiste kasvamist kaasaegsete sigimisbioloogia tehnoloogiate osas. Peale selle oli autoril unikaalne võimalus harjutada oma käega erinevaid võtteid antud valdkonnas. Taoline teoreetiline ning praktiline kogemus on tulevikus kasulik.
Viimaste aastate jooksul on loomade genoomiuuringud hoogustunud peamiselt geenitehnoloogia tehniliste võimaluste kiire arengu tõttu. Hiire ja veise embrüod on biomeditsiinilistes uuringutes laialdast kasutust leidnud, aidates selgitada embrüonaalse arengu geneetilisi kontrollmehhanisme. Imetajate rakkudel on võrreldes prokarüootse rakuga mitmeid erinevaid võimalusi geeniekspressiooni kontollimiseks. Viimaste aastate uuringud on keskendunud rakkude pluripotentsusega seotud geenide uurimisele. See on vajalik, kuna nimetatud geenidel on tähtis roll imetajate varajases arengus, samuti võivad nende uuringute tulemused oluliselt mõjutada embrüonaalsete tüvirakkude alaseid uuringuid. Hiljuti avaldatud uurimustöös (Suzuki Jr et al., 2009) selgus, et sõltuvalt veise embrüo tootmise tehnoloogiast, on loomade tiinestumine erinev. Leiti, et kunstliku seemenduse (artificial insemination, AI) puhul oli 40. päeval pärast seemendust 75% veistest tiined. Samas oli tiinestumine katseklaasi viljastamise (in vitro fertilization, IVF) puhul 50% ja somaatilise raku tuuma siirdamisel (somatic cell nucleus transfer, SCNT) ainult 30%. Eelnev viitab sellele, et embrüo varajases arengus on embrüote in vitro kasvutingimustel ja kloonitud embrüote reprogrammeerimise edukusel väga oluline roll. Võrreldes geeniekspressiooni profiile in vivo, in vitro ning SCNT embrüote vahel on näha, kuidas in vitro tingimuste muutmine mõjutab embrüo arengupotentsiaali. Käesoleva uuringu käigus eraldasime blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest ribonukleiinhappe (RNA) ning uurisime insuliinilaadset kasvufaktorit 1 (IGF1), insuliinilaadset kasvufaktorit 2 (IGF2) ning insuliinilaadse kasvufaktori siduva proteiini 6 (IGFBP6) kodeerivate geenide ekspressiooni. Embrüod saadi kas IVF või SCNT teel ja analüüsiti kolmest kuni kolmeteistkümnest embrüost koosnevate rühmadena. RNA eraldati embrüotest kasutades Qiagen RNeasy Plus Micro kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). Saadud RNA kvaliteeti analüüsiti kasutades Agilent 2100 Bioanalyzer’it ja RNA 6000 Pico kiipi (Agilent Technologies Inc., California, USA). Komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti kogu RNA-st kasutades Quantitect Reverse Transcription kitti (Qiagen Sciences, Maryland, USA). cDNA puhul kasutati geeniekspressiooni modelleerimiseks Taqman kvantitatiivse reaalaja polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) meetodil ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) abil. RNA kvaliteedi analüüsi tulemused näitasid, et kõikide proovide RNA kvaliteet oli rahuldav. IGF1 ekspressiooni tuvastada ei õnnestunud. IGF2 puhul oli ekspressiooni tase piiripealne ning seda õnnestus tuvastada neljas proovis seitsmest. IGFBP6 puhul oli mRNA tase tuvastatav kõikide proovide puhul. Tegemist oli embrüolabori esimeste katsetega, kus blastotsüsti arengujärgus veise embrüotest eraldati RNA ning analüüsiti geeniekspressiooni profiile. Käesolev uurimistöö aitas kaasa vastava metoodika väljatöötamisele. Lisaks praktilisele töö osale tuleb märkida autori teoreetiliste teadmiste kasvamist kaasaegsete sigimisbioloogia tehnoloogiate osas. Peale selle oli autoril unikaalne võimalus harjutada oma käega erinevaid võtteid antud valdkonnas. Taoline teoreetiline ning praktiline kogemus on tulevikus kasulik.
Kirjeldus
Märksõnad
RNA, geeniekspressioon, analüüs, veis, loode, magistritööd