Andmebaasi logo
 

Residues of some pharmaceuticals in sewage sludge in Estonia, their stability in the environment and accumulation into food plants via fertilizing

Pisipilt

Failid

Thesis (4.43 MB)

Kuupäev

2011

Kättesaadavus

Autorid

Ajakirja pealkiri

Ajakirja ISSN

Köite pealkiri

Kirjastaja

Eesti Maaülikool

Abstrakt

Maakera rahvastiku kasv toob kaasa üha uusi lahendamist vajavaid keskkonnaprobleeme. Intensiivistuva toiduainete tootmise tingimustes on vaja üha enam tähelepanu pöörata toiduohutuse tagamisele. Käesoleva doktoritöö autor on uurinud toidutekkelisi parasitaarja viirushaigusi (Lillenberg ja Järvis, 2005), toiduainete saastumist patogeensete bakteritega (Roasto et al., 2009; Meremäe et al., 2010; Roasto et al., 2011), tegelenud mullas ja toidutaimedes sisalduvate ravimijääkide määramismeetodite väljatöötamisega (Lillenberg, 2003; Lillenberg et al., 2003) ning reoveepuhastusalase probleemistikuga (Nei ja Lillenberg, 20091). Põhiline osa uurimistööst on aga seotud reoveesette kasutamisvõimaluste uurimisega mullaviljakuse tõstmisel. Reoveesete on väga toiteaineterikas, kuid lisaks toitainetele sisaldab see kahjuks mitmesuguseid saasteaineid, olles seega oma olemuselt ohtlik jääde. Vaatamata sellele on reoveesetet lubatud kasutada väetisena haljastuses, metsanduses ja ka põllumajanduses tingimusel, et see on muudetud ohutuks keskkonnale ning inimeste ja loomade tervisele. Rahvusvaheliselt ja siseriiklikult kehtivad regulatsioonid nõuavad raskemetallide, fekaalsete coli-laadsete bakterite ja helmintide munade sisalduse määramist, mis on aga sette ohutuse hindamise seisukohalt selgelt ebapiisav, sest selles sisalduvate bioloogiliste ja keemiliste kontaminantide hulk võib-olla mitmeid kordi suurem. Seetõttu leiab reoveesete julgemat kasutamist haljastuses, metsanduses ja prügilate katmisel kui põllumajanduses. Üha enam on hakatud reoveesetet koos muude kütustega põletama või sellest biogaasi tootma. Viimasel aastakümnel on pööratud varasemast suuremat tähelepanu keskkonna saastumisele ravimijääkidega. Kanalisatsiooni ja sealt edasi reoveesettesse satub ravimeid, mille liikumine ahelas reovesi – reoveesete – kompost – muld – taim – inimene (või loom) võib ohustada ahela viimast lüli. Reoveesettes sisalduvate ravimijääkide lagunemiskiiruse sõltuvust komposti valmistamise tehnoloogiast ei ole seni maailmas uuritud, see 90 on uudne ja oluline teema. Piisavalt ei ole uuritud ka ravimite liikumist väetatud mullast taimedesse. Teaduspublikatsioonides rõhutatakse ravimite taimedesse akumuleerumise väljaselgitamise tähtsust. Mõned laialdaselt kasutatavad antibiootikumid, näiteks tetratsükliinid ja fluorokinoloonid, säilivad mullas kaua. Laborkatsed on kinnitanud, et sulfoonamiidid ja fluorokinoloonid akumuleeruvad taimedesse, sh. toidutaimedesse. Erinevalt loomorganismist puudub taimedel väljutusmehhanism ning seetõttu võivad ravimid taimedes kontsentreeruda. Kasvuperioodi lõpuks võib taime ravimisisaldus olla suurem kui kasvumullas ja ületada loomsele toidutoormele kehtestatud piirnormi, millega kaasneb oht inimese tervisele (Lillenberg et al., 2003). Tuginedes teadaolevatele andmetele, uuriti keskkonnas kauapüsivate ja potentsiaalselt taimedesse akumuleeruvate ravimijääkide sisaldust Eesti suuremate linnade, Tallinna ja Tartu, reoveesettes, nende lagunemist sette töötlemise käigus ja akumuleerumist mullast toidutaimedesse. Uuritavate ravimite valikul lähtuti ka eelnevatel aastatel Eestis müüdud ravimite kogustest (Eesti ravimistatistika 2002–2006; Eesti ravimistatistika 2006– 2008). Ravimijääkide sisaldust reoveesettes ja kompostis ei ole Eestis varem uuritud. Esmakordselt uuriti ravimite akumuleerumist mullast toidutaimedesse madalate ravimikontsentratsioonide korral, millised võiksid reoveesettega väetatud mullas esineda. Reoveesette ja komposti proovid võeti AS Tallinna Vesi ja AS Tartu Veevärk reoveepuhastusjaamadest. Katsemullad valmistati ette Eesti Maaülikooli PKI mullateaduse ja agrokeemia osakonnas. Taimkatsed viidi läbi Luunjas, AS Grüne Fee kasvuhoones. Kromatograafilised analüüsid teostati Tartu Ülikooli Keemiainstituudis. Taimkatseteks valiti lehtsalat (Lactuca sativa L), porgand (Daucus carota L), kartul (Solanum tuberosum L) ja nisu (Triticum vulgare L). Käesolevas töös kasutatud uurimismetoodikate väljatöötamine ja töö tulemused on leidnud kajastamist ISI teadusartiklites (Lillenberg et al., 2009; Lillenberg et al., 20101; Lillenberg et al., 20102; Kipper et al., 2010). Töö tulemusi on esitletud ka mitmetel rahvusvahelistel konverentsidel (SETAC Varssavi, 2008; SETAC Tampa, 2008; CNSSS Tallinn, 2009; ICEST Bangkok, 2010; SETAC Sevilla, 2010; ICBEE Kairo, 2010) ning populaarses vormis ajakirjas „Keskkonnatehnika“ (Nei ja Lillenberg, 20092). 91 8.2. Kirjanduse ülevaade Keskkonna saastumine ravimitega on muutunud oluliseks uurimisvaldkonnaks. Läbinud inimese või looma organismi, väljuvad ravimid kas muundumata kujul või metaboliitidena keskkonda. Neid on leitud sõnnikus ja reovees, reoveesettes ja pinnavees, kompostväetises ja väetatud mullas. Ravimid võivad keskkonnas kahjulikeks osutuda, kuna nad on loodud eesmärgiga mõjutada bioloogilisi objektide. Neil on sageli biostruktuuridega sarnased füüsikalis-keemilised omadused nagu lipofiilsus, mis võimaldab läbida biomembraane ja stabiilsus, mis hoiab ära nende inaktiivseks muutumise enne raviefekti tekitamist. Nii on ravimitel olemas vajalikud omadused, et akumuleeruda organismides ja kutsuda esile muutusi vee ja pinnase ökosüsteemides (Halling- Sørensen et al., 1998). Sõnniku või reoveesette kompostväetise koostises jõuavad ravimid põllumajandusmaadele. Osa neist lagundatakse mulla mikroorganismide poolt mõne päeva või nädala jooksul (Thiele-Bruhn, 2003), stabiilsemad võivad mullas muutumatuna säilida isegi üle aasta (Golet et al., 2002). Reoveesette kasutamine põllumajandusväetisena on globaalne probleem. Seoses maailma rahvastiku kiire kasvuga suurenevad ka reovee töötlemisel tekkiva sette kogused, mis tuleb puhastitest eemaldada. Reoveepuhastite territooriumitele kuhjuvad kompostihunnikud, mille utiliseerimine ei ole kerge. Kuigi reoveesette kompost on kahtlemata hea orgaaniline väetis, võib see osutuda keskkonnale, inimesele ja loomadele ohtlikuks nende keemiliste või bioloogiliste kontaminantide sisalduse tõttu, mille regulaarset kontrollimist reoveesette kasutamise määrus ette ei näe (ravimijäägid, patogeensed bakterid, seened, viirused). Komposti kasutamine haljastusväetisena või rekultiveerimiseks Eestis probleeme ei tekita, põllumajandusväetisena leiab kompost kasutamist palju harvemini. Ravimeid fluorokinoloonide, sulfoonamiidide ja tetratsükliinide rühmadest on leitud mitmel pool maailmas reovees, reoveesette koostises ja puhastatud vees (Golet et al., 2002; Lindberg et al., 2005; Göbel et al., 2005; Okuda et al., 2009; Spongberg and Witter, 2008; Gros et al., 2007) Reoveesette töötlemise tehnoloogiad on erinevad, kuid kõik need peaksid tagama sette ohutuse keskkonnale ning inimeste ja loomade tervisele. Töötlemata reoveesette kasutamine põllumajanduses on keelatud. Euroopa Liidus, sh. Eestis kehtiv reoveesette kasutamise määrus lubab 92 töödeldud reoveesetet kasutada põllumajandusväetisena, kui see ei sisalda üle normi fekaalseid coli-laadseid baktereid, raskemetallide jääke ega helmintide mune. Teiste bioloogiliste või keemiliste kontaminantide sisalduse kontrollimine ei ole kohustuslik (Riigi Teataja I, 2004). Kuigi on andmeid, et ravimid jõuavad mullast taimedesse, piirnormid ravimite jääkidele taimses toidutoormes puuduvad. Loomsele toidutoormele kehtestatud MRL (maximum residue limit – ravimijäägi maksimaalne lubatud sisaldus) sõltub ravimi farmakoloogilistest omadustest, looma liigist ja koest (EMA/EPMARs). Osa allikaid väidab, et ravimijääkide „omastamine” mullast on tühine (Boxall et al., 2006; Thiele Bruhn, 2003). Teised autorid, vastupidi, peavad ravimite akumuleerumist mullast toidutaimedesse sedavõrd tõsiseks probleemiks, et on teinud ettepaneku kehtestada MRL ka taimsele toidutoormele (Brambilla et al., 1996). Artiklis (Jjemba, 2002) rõhutatakse ravimite taimedesse akumuleerumise uurimise olulisust. Vajalikuks peetakse ka ravimite degradatsiooni uurimist reoveesette erinevate töötlemistehnoloogiate korral. Vähestes töödes on uuritud ravimijääkide sisalduse vähenemist sõnniku kompostimisel (Dolliver et al., 2008). Ravimijääkide degradatsiooni reoveesette kompostimise käigus ei ole maailmas seni uuritud. Euroopa Liidus puuduvad normatiivid ravimijääkide sisalduse kohta reoveesette kompostis (EU Council Directive 86/278/EEC, 1986). Soovitatavad veterinaarravimite sisalduse piirnormid sõnnikus on 100 μg/kg ja sõnnikuga väetatud mullas 10 μg/kg (EMEA/CVMP/055/96, 1996). Kuid need normid on tänaseks seatud kahtluse alla kui liiga kõrged. Euroopa Liidu Teaduskomitee toksikoloogia, ökotoksikoloogia ja keskkonna küsimustes (EU ESCTEE) peab antud piirnorme mitteteaduslikeks, kuna need ei välista ohtu kõigile mulla mikroorganismidele. Uueks, keskkonnale ohutuks ravimisisalduse piirnormiks mullas pakutakse 1 μg/kg. See on arvutatud arvestades erinevate ravimite MIC-i (Minimum Inhibitory Concentration – minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon) väärtusi mulla mikroorganismidele. MIC-l põhinev ravimisisalduse piirnorm ei välista aga ravimresistentsuse arenemist mullamikroobidel. Selleks piisab palju väiksemast ravimikontsentratsioonist mullas – MEC (Minimum Effect Concentration - minimaalse mõju kontsentratsioon), mille juures mikroobide kasv aeglustub (O´Reilly and Smith, 1999). Ravimresistentsuse teket välistav ravimisisaldus mullas ei tohiks ületada 0,01–0,1 μg/kg (Montforts, 2005). 93 Anaeroobse töötlemisega ohutuks muudetud reoveesettest on leitud fluorokinoloonide jääke kontsentratsioonides 2130-2420 μg/kg (Golet et al., 2002), mis ületab ravimisisalduse piirnormi sõnnikus 100 μg/kg (EMEA/CVMP/055/96, 1996) üle kahekümne korra. Reoveesettega väetatud mullast on leitud fluorokinoloonide jääke 21 kuu pärast: tsiprofloksatsiini keskmiselt 270 μg/kg ja norfloksatsiini 300 μg/kg kohta (Golet et al., 2002). Walters et al. (2010) näitasid fluorokinoloonide pikaajalist säilimist reoveesettega väetatud mullas. Vahetult pärast reoveesette laotamist oli tsiprofloksatsiini sisaldus mullas 542 ja ofloksatsiini sisaldus 470 μg/kg (kuivaine kohta). 994 päeva pärast ei olnud kumbki antibiootikum mullas lõplikult lagunenud, nende sisalduseks saadi 390 μg/kg (tsiprofloksatsiin) ja 267 μg/kg (ofloksatsiin) (Walters et al., 2010). Sulfoonamiide on leitud reoveesetetest (Göbel et al., 2005) ja puhastatud reoveest (Göbel et al., 2004; Lindberg et al., 2005), sulfametoksasool ei ole reoveepuhastis biodegradeeritav (Richardson and Bowron, 1985). Reoveesette kompostimise käigus ei pruugi laguneda fluorokinoloonide ja tetratsükliinide jäägid. Nende aeglast degradeerumist põhjendatakse tugeva seondumisega tahketele osakestele (Marengo et al., 1997; Carmosini and Lee, 2008). Kaks nädalat pärast väetamist seasõnnikuga tuvastati tetratsükliini sisaldus erinevatelt sügavustelt võetud mullaproovides 195 ja 254 μg/kg (Sczesny et al., 2003). Seitse kuud pärast väetamist võetud mullaproovides oli keskmine tetratsükliini sisaldus 65,5 μg/kg (Hamscher et al., 2002). Kõik eeltoodud ravimijääkide sisaldused mullas ületavad mullale kehtestatud ravimite piirnormi 10 μg/kg kümneid kordi, teaduslikult põhjendatud mullaorganismidele ohutu piirnormi 1 μg/kg sadu kordi ja mullamikroobide ravimresistentsuse arenemist ennetava piirnormi 0,01–0,1 μg/kg tuhandeid kordi. Alates 1940. aastast kuni tänaseni on antibakteriaalsete ainete tootmine ja tarbimine maailmas mitmekordistunud, sama aja jooksul on oluliselt suurenenud ka bakterite antibiootikumresistentsus, nii ohutute kui ka patogeensete bakterite hulgas. Tetratsükliini resistentsust määrava geeni esinemissagedus on mullabakterite hulgas ajavahemikul 1970– 2008 kasvanud 15 korda, põhjuseks väetamine tetratsükliine sisaldava sõnniku või reoveesette kompostiga (Knapp et al., 2010). Reoveesettes ja settekompostis esinevad bakterid on sageli antibiootikumresistentsed, kuna on elanud pikka aega antibiootikume sisaldavas keskkonnas 94 (Reinthaler et al., 2003; Sahlström, et al., 2009). Niisuguste bakterite sattumine keskkonda põhjustab ravimresistentsuse levikut. Mullabakterite antibiootikumresistentsus kujutab endast potentsiaalset ohtu inimeste ja loomade tervisele, sest resistentsust määravad geenid võivad transformeeruda ohututelt mullabakteritelt patogeensetele bakteritele horisontaalse geeniülekande teel (Davies, 1994). Taimkatsed on näidanud, et antibakteriaalsed ained fluorokinoloonide, tetratsükliinide ja sulfoonamiidide rühmast akumuleeruvad mullast taimedesse (Migliore et al., 1995; Brambilla et al., 1996; Aruksaar et al., 1998; Aruksaar et al., 1999; Lillenberg et al., 2003; Boxall et al., 2006). Sel teel on võimalik ravimite sattumine mullast inimese toidulauale või loomasööda koostisesse. Erinevalt loomorganismidest, kus ravimite jäägid väljuvad ekskrementidega, taimedel väljutusmehhanism puudub. Seetõttu on võimalik ravimijääkide kontsentreerumine pika kasvuperioodi jooksul (Lillenberg, et al., 2003). Tulemuseks võib olla kõrgem ravimijääkide sisaldus toidutaimedes, kui on lubatud loomsetes toitudes. Loomsele toormele kehtestatud MRL tuleneb ADI arvust (acceptable daily intake – päevane lubatud doos). ADI on päevas tarbida lubatud aine kogus inimese kehakaalu 1 kg kohta kogu eluaja jooksul, ilma tervist kahjustamata. Eristatakse toksikoloogilist ADI - aine ohutut doosi vältimaks otseseid kahjulikke kõrvaltoimeid organismile ja mikrobioloogilist ADI – aine ohutut doosi organismi normaalsele mikrofloorale, kusjuures ADItox > ADImic. Loomsele toormele kehtestatud MRL põhineb mikrobioloogilisel ADI arvul (EMA/EPMARs; EMEA/MRL/398/98). Toiduga saadav ravimikogus peab olema ohutu ka inimese organismis resideerivatele bakteritele. Mõnede ravimite puhul on antud piirnormid algse ravimi ja tema metaboliitide summaarse sisalduse kohta: näiteks enrofloksatsiin (EMEA/ MRL/820/02), mille peamiseks metaboliidiks loomorganismides on tsiprofloksatsiin (Mengozzi et al., 1996; Küng et al., 1993). Esimene neist on kasutusel ainult veterinaarmeditsiinis, teine ainult humaanmeditsiinis. Ka taimedes metaboliseerub omastatud enrofloksatsiin tsiprofloksatsiiniks. 10 mg/kg enrofloksatsiini sisaldusega mullas kasvanud salatis vedelikkromatograafilise HPLC meetodiga määramisel oli enrofloksatsiini ja tsiprofloksatsiini sisaldus vastavalt 300 μg/kg ja 70 μg/kg. Enrofloksatsiini ja tsiprofloksatsiini summaarseks sisalduseks 95 salatis saadi 370 μg/kg, mis ületab piimas ja lihas lubatud MRL 100 μg/ kg (EMEA/MRL/820/02) üle kolme korra (Lillenberg et al., 2003). Kuna taimedele ei ole MRL kehtestatud, on võimalik taimse toidu ohutust hinnata lähtuvalt loomsele toormele kehtestatud piirnormist (EMEA/ MRL/026/95; EMEA/MRL/820/02). Mõnede käesolevas töös uuritud ravimite puhul (norfloksatsiin ja ofloksatsiin) MRL loomse toorme jaoks puudub, sest need ravimid on kasutusel ainult humaanmeditsiinis. Norfloksatsiini ja ofloksatsiini sisaldust taimedes võib tinglikult võrrelda tsiprofloksatsiini ja enrofloksatsiini lubatud summaarse sisaldusega. 8.3. Uurimistöö eesmärgid 1. Uurida Eesti reoveesetet ning sette komposti mõningate keskkonnas kauem püsivate ja/või potentsiaalselt taimedesse akumuleeruvate antibakteriaalsete ainete: fluorokinoloonide, sulfoonamiidide ja tetratsükliinide leidumise suhtes. 2. Anda hinnang erinevatele komposti valmistamise tehnoloogiatele komposti ohutuks muutmise seisukohalt. 3. Uurida valitud ravimite akumuleerumist mullast toidutaimedesse. 4. Hinnata reoveesette komposti kui põllumajandusväetise ohutust, arvestades keskkonnakaitse ja toiduhügieeni nõudeid. 8.4. Materjal ja metoodika 8.4.1. Reoveesette ja komposti uuringud Tallinna ja Tartu reoveesetet ja reoveesette komposti analüüsiti aasta jooksul. Tartus ja Tallinnas on reoveesette stabiliseerimise meetodid erinevad: Tartus toimub pressitud sette aunkompostimine: 25%-lise kuivainesisaldusega sete viiakse väljale aunadesse ja segatakse tugiainega (purustatud puukoor) vahekorras ~1/1. Reoainetebakteriaalse lagundamise tulemusena tõuseb aunas temperatuur kuni +71 °C. Aeroobsete bakterite elutegevuseks vajalike tingimuste tagamiseks segatakse aunasid mitu korda kuus. Tallinnas on kasutusel biopuhastis settinud toormuda anaeroobne stabiliseerimine – metaankääritamine 96 +37 °C juures. Anaeroobsete bakterite metabolismi tulemusena peaksid lagunema keemilised kontaminandid. Kääritatud sete, kuivainesisaldusega 28%, viiakse väljale aunadesse ja segatakse tugiainega (turvas) vahekorras 1/0,75. Aunade segamine toimub üks kord kuus. Reoveesette proovid võeti enne segamist tugimaterjaliga. Mõlemas linnas võeti settest kolm proovi igal kuul aasta jooksul. Kompostiproovid võeti mõlemas linnas 2, 6 ja 12 kuud seisnud aunadest, kuus proovi auna erinevatest kohtadest. Kokku võeti 144 proovi, neist pooled Tartust, pooled Tallinnast. Ligikaudu 200 g reoveesetet või komposti koguti 500 ml mahuga klaaspurki, segati ja kaeti hermeetiliselt suletava kaanega. Enne analüüsimist hoiti proove temperatuuril +4 °C. Analüüsid teostati reeglina ühe nädala jooksul. Pikemaks säilitamiseks hoiti proove sügavkülmas –80 °C. Töötati välja uus metoodika kolme antibiootikumide klassi - tetratsükliinide (TC), fluorokinoloonide (FQ) ja sulfoonamiidide (SA) määramiseks reoveesettes ja kompostis. Tsiprofloksatsiini (CIP), norfloksatsiini (NOR), ofloxatsiini (OFL), sulfadimetoksiini (SDM), sulfametoksasooli (SMX), tetratsükliini (TCL) ja doksütsükliini (DOX) ekstraheerimiseks kasutati PLE (pressurized liquid extraction) meetodit, ekstraktide puhastamiseks SPE (solid phase extraction) meetodit ja ekstraktid analüüsiti LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry) meetodil. PLE. Ekstraktsioon viidi läbi kasutades ekstraheeriva solvendina 0,35% fosforhappe ja atsetonitriili segu 1:1, pH 2,5. Ekstraktsiooni aeg: 10 min, temperatuur: 100–110 °C, rõhk: 100–110 atm., kordus: 5 tsüklit. SPE. Ekstrakti puhastamiseks kasutati kahte erinevat tüüpi ekstraktsioonipadruneid: SCX (strong cation-exchange) ja HLB (hydrophiliclipophilic balance). Sulfoonamiidide määramisel andsid kõrgema saagise SCX padrunid, fluorokinoloonide ja tetratsükliinide puhul HLB padrunid. Kuigi sulfoonamiidide saagis HLB padrunite kasutamisel langes, jäi see siiski aktsepteeritavale tasemele. Seepärast kasutati edaspidi kõigi kolme antibiootikumide grupi üheaegseks määramiseks ainult HLB padruneid. LC-MS. Antibiootikumide sisalduse määramiseks reoveesettes ja kompostis kasutati instrumenti Agilent Series 1100 LC- MSD Trap XCT. Meetodi määramispiirid olid HLB 97 padrunite kasutamise korral CIP 1,8; NOR 1,3; OFL 0,8; SMX 0,1; SDM 0,1; DOX 80 ja TCL 160 μg/kg. Standardhälbed olid vastavalt 0,18; 0,13; 0,08; 0,01; 0,01; 7,7 ja 15,7. Saagiste protsent varieerus olenevalt ainest ja ekstraktsioonipadruni tüübist. Materjalide ja metoodika detailne kirjeldus on avaldatud artiklis II (Lillenberg et al., 2009). 8.4.2. Taimede kasvatamine, proovi ettevalmistamine ja uuringud Taimi kasvatati kasvuhoones plastikpottides, kahes erinevas mullas: liiv-savi mullas pHKCl 6,7; niiskusesisaldus 19,5% ja savi-liiv mullas pHKCl 6,9; niiskusesisaldus 8% (Lisa 1). Antibiootikumid lisati mulda vesilahustena, nii et kõikide ainete lõppkontsentratsiooniks potis oli 10, 100, 500, 1000 μg/kg või 10 mg/kg mulla kuivkaalu kohta. Parema lahustuvuse saavutamiseks lahustati fluorokinoloonid eelnevalt 2 ml-s 0,1 mM ammooniumatsetaat/metanool puhverlahuses (75/25), pH 2,8 (kohandatud 0,1%-lise sipelghappega). Sulfoonamiidid lahustati eelnevalt 2 ml 0,3 M NaOH vesilahuses. Iga kontsentratsiooni jaoks võeti kolm paralleelpotti. Kontrolliks kasvatati taimi antibiootikumidevabas mullas, samuti kolmes paralleelpotis. Katsetaimedeks olid lehtsalat (Lactuca sativa L), porgand (Daucus carota L), kartul (Solanum tuberosum L) ja nisu (Triticum vulgare L). Lehtsalati ja porgandi seemned osteti kauplusest, nisuseemned ja kartulid saadi EMÜ Põllumajandus- ja keskkonnainstituudi mullateaduse ja agrokeemia osakonnast. Mulla kogused pottides olid kartulil 5, nisul 3, porgandil 1,5 ja salatil 0,5 kg. Salati kasvuaeg viie antibiootikumi juuresolekul alates seemnete külvamisest oli 70 päeva, teistel taimedel 120 päeva (kartulil alates kartuli muldapanekust). Seejärel taimed koristati ja eraldati võsud juurtest. Mullaga kokkupuutunud taimeosad pesti hoolikalt jooksva vee all. Söödavad osad kuivatati eraldi: salatil lehed, kartulil mugulad, porgandil peajuur ja nisul terad. Kartulid ja porgandid tükeldati enne kuivatamist. Kuivatamine toimus pimedas ruumis, et vältida fotokeemilisi reaktsioone, mis võiksid põhjustada fluorokinoloonide lagunemist (Hooper and Wolfson, 1991). Kuivanud taimed jahvatati peeneks purustusveskis. Täieliku kuivkaalu saavutamiseks hoiti taimset materjali termostaadis +45 °C juures 24 tundi. Enne analüüsimist hoiti taimede proove hermeetilistes plastikaatkottides sügavkülmas temperatuuril –80 °C. 98 Antibiootikumid ekstraheeriti taimsest materjalist LE (liquid extraction) meetodil. Ekstraktid puhastati SPE meetodil ja analüüsiti LC-MS metodil. LE. Antibiootikumid ekstraheeriti kuivatatud taimsest materjalist atsetonitriili ja äädikhappe seguga 1:1. SPE. Ekstraktide puhastamiseks kasutati HLB padruneid. LC-MS. Antibiootikumide sisalduse määramiseks kasutati instrumenti Agilent Series 1100 LC-MSD Trap XCT. Ekstraheerimist on detailselt kirjeldatud artiklis V (Lillenberg et al., 20102). Antibiootikumide saagised varieerusid kõikide proovimaatriksite piirides 54-98%. Valideerimine teostati maatriksis, kus saavutati kõige madalam saagise protsent (porgandi juur liiv-savimullas: 54-78%), seega on valideerimise hinnang metoodikale antud konservatiivselt. Meetodi määramispiirid varieerusid sõltuvalt antibiootikumist: CIP 108,3; NOR 162,2; OFL 22,9; SDM 71,2 ja SMX 130,6 μg/kg. Standardhälbed olid vastavalt 2,7; 4,1; 0,6; 1,8 ja 3,3. Tulemused, mis jäid alla määramispiiri, näitavad küll antibiootikumide vähest sisaldust porgandis, kuid ei pruugi olla täpsed. Teistes taimedes mulla madalamatel kontsentratsioonidel saadud tulemuste usaldusväärsus on suurem. Antibiootikumide sisaldus määrati taimede söödavates osades: salati lehtedes, kartuli mugulates, porgandi juurtes ja nisu terades. Analüüsid tehti ka mõnedest mittesöödavatest taimeosadest: nisu ja porgandi lehtedest ning salati juurtest. Võrreldi antibiootikumide akumuleerumise ulatust taimede juurtesse ja lehtedesse ning samasse taimeosasse kahest erineva lõimisega mullast. Kokku tehti taimedest 154 analüüsi. 8.5. Tulemused ja arutelu 8.5.1. Antibiootikumide sisaldus reoveesettes ja kompostis Uuritud reoveesetted sisaldasid fluorokinoloonide ja sulfoonamiidide jääke. Tetratsükliinide jääke setetest ei leitud. Sulfoonamiide leiti peaaegu kõigis setteproovides, kuid alla sõnnikule kehtestatud piirnormi 100 μg/ kg. Fluorokinoloonide sisaldus tuvastati enamuses Tartu setteproovides 2-4 korda üle piirnormi, Tallinnas ainult mõnedes proovides, kuid 99 2-15 korda üle piirnormi. FQ kõrged sisaldused nii Tallinna kui Tartu reoveesetetes ilmnesid jaanuaris või veebruaris, Tartus ka augustis. Antibiootikumide keskmised sisaldused Tallinna ja Tartu reoveesetetes on esitatud joonistel (Figure 9, 10). Võetud proovide arvu juures (3 proovi 1 kord kuus) ei saa väita, et FQ sisalduse tõusud ja langused kuude lõikes oleks seaduspärasus. Antibiootikumide sisaldus reovee setetes varieerus mitte ainult kuude lõikes, vaid ka sama päeva proovides. Tetratsükliini reoveesettest ei leitud, kuid selle sisaldus tuvastati reovees. Doksütsükliini ei leitud ka reoveest. Tetratsükliini müüdud kogused on võrreldes fluorokinoloonidega väiksemad (Eesti ravimistatistika, 2002– 2006; Eesti ravimistatistika, 2006–2008). Kuna TCL kasutatakse põhiliselt oftalmoloogias, satub see antibiootikum kanalisatsiooni harvemini. Reoveesette kompostimisel antibiootikumid lõplikult ei lagunenud. Ravimijääkide kontsentratsioonid 2-, 6- ja 12-kuu vanustes kompostiaunades on esitatud tabelites (Table 10, 11). Kuus kuud seisnud kompostides leiti kõiki FQ jääke nii Tartus kui Tallinnas, SA jääke leiti ainult Tartus. FQ ja SMX jääke leiti Tartu kompostis veel 12 kuu pärast, Tallinnas olid need selleks ajaks lagunenud. SDM jääke 12 kuu vanusest kompostist ei leitud ei Tartus ega Tallinnas. Antibiootikumide sisaldus kompostis oleneb nende sisaldusest settes, mis on nii kuude kui päevade lõikes ebaühtlane. Lisaks algmaterjalile oleneb antibiootikumi sisaldus kompostiproovis proovivõtu kohast, sest ka kompostiaunas, ehkki seda segatakse mitmeid kordi, ei ole antibiootikumide sisaldus ühtlane. Aasta keskmise fluorokinoloonide sisalduse arvutamine kompostis ei oma mõtet, sest kunagi ei segata kokku erinevate kuude reoveesettest valmistatud kompostiaunu. Põllule või haljasalale viiakse Tallinnas sama kuu settest valmistatud 6–8 kuud seisnud kompostiaun. Tartus viiakse samavana kompost nn. järelvalmimisauna, kus enam segamist ei toimu. Fluorokinoloonid adsorbeeruvad tugevasti tahkete osakeste külge ega eemaldu sealt kergesti. See võimaldab seletada FQ erinevaid kontsentratsioone sama päeva reoveesettes ja sama kuu kompostiaunas, samuti nende kõrgemaid sisaldusi kuus kuud seisnud kompostis võrreldes kaks kuud seisnud kompostiga. Kompostiaunade keskmine FQ sisaldus on arvutatud kuue juhusliku proovi analüüsitulemuste järgi ja ei pruugi väljendada 100 tonnise auna tegelikku keskmist fluorokinoloonide 100 sisaldust. Kohati kõrge FQ sisaldusega ühe aasta vanune Tartu kompost võib põllule laotatuna põhjustada lokaalselt kõrgeid antibiootikumide sisaldusi mullas, mis ületavad mulla jaoks soovitatud piirnormi 10 μg/kg ja on kümneid kordi kõrgem teaduslikult põhjendatud piirnormist 1 μg/kg. Ühe aasta vanune Tallinna kompost sisaldas antibiootikumide jääke minimaalselt, millest võib järeldada, et Tallinnas kasutatav sette segamine turbaga on ravimijääkide eemaldamisel efektiivsem, kui kompostimine puukoorega Tartus. Küll aga sisaldas Tallinnas antibiootikumide jääke kuue kuu vanune kompost, mis loetakse juba valminuks ja turustamiskõlbulikuks (Figure 15). 8.5.2. Antibiootikumide akumuleerumine mullast taimedesse Kõige suuremates kogustes akumuleerusid taimedesse SMX ja SDM. Loomsele toormele kehtestatud piirnorm lubab SA summaarseks sisalduseks 100 μg/kg. Katsetaimedes leiti mõnel juhul sellest palju kõrgemaid kontsentratsioone, kuid ainult 10, 1 ja 0,5 mg/kg antibiootikumide sisaldusega mullas kasvanud taimedes. Kõige madalam mulla ravimite sisaldus, millest taimed antibiootikume omastasid oli 0,01 mg/kg (Table 13, 14). Kõrgemad antibiootikumide sisaldused leiti taimede maa-alustes osades (Table 15, 16). Savi-liivmullast omastasid taimed antibiootikume reeglina rohkem kui liiv-savimullast (Figure 26, 27). Antibiootikumide sisaldus mullas 10 mg/kg avaldas negatiivset mõju taimede kasvule ning osutus mõne taime puhul letaalseks. Hävinud nisuja salatitaimede lehtedes tuvastati SA summaarne sisaldus üle 900 μg/ kg, salati juurtes üle 7000 μg/kg. Suuremates kogustes antibiootikume omastanud nisu ja salati lehtedes tekkis kloroos, taimed hakkasid närbuma 30. päeval ja eksperimendi lõpuks hävisid täielikult. Kloroosi teket on seostatud CIP akumuleerumisega lehtedes (Lillenberg, 2003). Fluorokinoloonidel on omadus adsorbeeruda mullaosakeste külge, seepärast on väga raske saavutada nende ühtlast kontsentratsiooni mullas. Nende akumuleerumine taimesse võib sõltuda ka juurte asukohast katsemullas. FQ ebaühtlane sisaldus mullas võib olla põhjuseks, miks mõnel juhul antibiootikumide kontsentratsioonid taimedes ei vähene korrellatsioonis kontsentratsioonide langusega mullas. 101 Antibiootikumide kergem omastamine savi-liivmullast on loogiline, sest desorptsioon toimub saviosakeste küljest raskemini (Nowara et al., 1997). Taimede maa-alused osad, juured ja mugulad, on esimesed, kuhu antibiootikumid mullast jõuavad, seetõttu nende kõrgem sisaldus juurtes ja mugulates on ootuspärane. Kas lehtedessse jõuab uuritud antibiootikume tõepoolest vähem, kui maa-alustesse osadesse, või toimub lehtedes valguse mõjul FQ fotodegradatsioon (Hooper and Wolfson, 1991) ei ole antud töö põhjal võimalik öelda. Lehtedes toimuvate metabolismi protsesside tõttu on võimalik uuritud ainete muundumine nende metaboliitideks (Lillenberg et al., 2003), mille sisaldust taimes ei uuritud, kuid mis võivad samuti omada antibakteriaalset toimet. Teostatud uuring näitas, et fluorokinoloonid võivad akumuleeruda mullast toidutaimede söödavatesse osadesse, kui nende kontsentratsioon mullas on vähemalt 10 μg/kg. Kas selline akumuleerumine toimub ka reoveesette kompostiga väetatud mullast, vajab kontrollimist põllukatsetega. 8.5.3. Reoveesette komposti sobivus põllumajandusväetiseks Antibiootikumide akumuleerumine toidutaimedesse võib osutuda ohtlikuks, sest taimse toiduga üliväikestes kogustes antibiootikumide omastamine põhjustab inimese organismis bakterite ravimresistentsuse kujunemise, mistõttu isegi siis, kui antibiootikumi sisaldus taimes jääb alla lihale ja piimale kehtestatud MRL, võib see olla ohtlik. Mitmesuguste antibiootikumide jääke sisaldavate toitude üheaegsel söömisel (näiteks liha, kartul, piim, lehtsalat, porgand) võib esineda ADImic ületamine. Käesolevas uurimistöös akumuleerusid antibiootikumid mullast toidutaimedesse suuremas koguses, kui lubab MRL loomses toormes, kuid ainult mulla kõrgemate ravimi kontsentratsioonide juures: 0,5, 1 ja 10 mg/kg. Nii kõrged ravimite kontsentratsioonid võivad esineda mullas, kui väetamine toimub anaeroobselt töödeldud, kuid tugiainega täiendamata reoveesettega, milles FQ ja SA sisaldus on üle 1 mg/kg. Eestis nii kõrgeid ravimite kontsentratsioone tõenäoliselt mulda ei satu, sest väetamine toimub kompostiga, milles antibiootikumide sisaldused leiti olevat alla 100 μg/kg. Piirkontsentratsiooniks, mille juures antibiootikumide akumuleerumist mullast taimede söödavatesse osadesse veel täheldati, oli 10 μg/kg. Tartu ja Tallinna turustamiseks valmis kompostist leiti FQ rohkem kui 10 või ligi 10 μg/kg (CIP 9, 102 OFL 8 μg/kg). Need arvud ei ole konstantsed suurused, vaid muutuvad, sõltudes ravimite tarbimisest konkreetsel ajal, konkreetses linnas või asulas. Mulla ravimisisalduse piirnorm 10 μg/kg ei ole piisav vältimaks antibiootikumide akumuleerumist toidutaimede söödavatesse osadesse. Ohu hindamisel tuleb lähtuda ravimijääkide sisalduse teaduslikult põhjendatud piirnormist mullas 1 μg/kg. Töös uuritud FQ sisaldused turustamiseks valmis kompostis olid sellest kümneid kordi suuremad (Tartus OFL 8, NOR 64, CIP 70 μg/kg; Tallinnas OFL 8, NOR 17, CIP 9 μg/kg). Sellise kompostiga väetamisel võivad mullas kujuneda lokaalselt küllalt kõrged, mulla mikroobidele letaalsed FQ kontsentratsioonid. SA kontsentratsioon turustamiseks valmis kompostis oli küll madal (Tartus SMX 2 μg/kg), kuid siiski kõrgem piirnormist, mistõttu väetamine niisuguse kompostiga võiks põhjustada ravimresistentsuse kujunemise mulla mikroobidel ja selle võimaliku ülekandumise patogeenidele. Ainult ravimisisalduse piirnormi 1 μg/kg rakendamisel kompostile võime eeldada, et mullas ei ületa ravimisisaldus bakterite antibiootikumresistentsust ennetavat kontsentratsiooni 0,01–0,1 μg/kg (Montforts, 2005). 8.6. Kokkuvõte ja järeldused Töötati välja uus meetod sulfoonamiidide, fluorokinoloonide ja tetratsükliinide grupi antibiootikumide üheaegseks ekstraheerimiseks reoveesettest ja kompostist. Uuriti nende antibiootikumide sisaldust Tartu ja Tallinna reoveesettes ühe aasta jooksul, sisalduse muutust sette kompostimise käigus ja akumuleerumist mullast toidutaimedesse settes esinevate kontsentratsioonide juures. Võrreldi erinevate sette töötlemise tehnoloogiate efektiivsust antibiootikumide sisalduse vähendamisel. Töö tulemused on globaalse tähtsusega, sest andmed ravimisisalduste vähenemise kohta reoveesette töötlemise käigus, samuti ravimite akumuleerumise kohta mullast toidutaimedesse on uudsed kogu maailmas. Fluorokinoloonide sisaldus reoveesetetes oli kohati kõrge (CIP kuni 1520 μg/kg; NOR kuni 580 μg/kg; OFL kuni 157 μg/kg), kohati madal, varieerudes kuude ja isegi ühe päeva lõikes. Sulfoonamiidide sisaldus oli reoveesetetes alati madal. Tetratsükliine Eesti reoveesettest ega kompostist ei leitud, seepärast nende taimedesse akumuleerumist ei uuritud. Samas ei ole välistatud, et tetratsükliine võib sisalduda teiste riikide reoveesetetes, kui neid tarvitatakse suuremates kogustes ja sette 103 töötlemise tehnoloogiad erinevad meil kasutatavatest. Tetratsükliinide akumuleerumine mullast toidutaimedesse pakub teaduslikku huvi ja võiks olla edasiste uuringute teemaks. Tallinna ja Tartu realiseerimisvalmis reoveesette kompost sisaldas antibiootikumide jääke kogustes, mis ületasid nii soovitusliku piirnormi mullale 10 μg/kg kui ka teaduslikult põhjendatud piirnormi 1 μg/kg. Niisugused antibiootikumide kogused kompostväetises võivad osutuda ohtlikuks mullaelustikule, rikkudes sealset bioloogilist tasakaalu, samuti inimestele ning loomadele, põhjustades antibiootikumresistentsuse sagenemist mullabakteritel ja selle võimalikku ülekandumist patogeenidele. Kõige rohkem sisaldas realiseerimisvalmis kompost CIP (70 μg/kg), seejärel NOR (64 μg/kg), OFL (8 μg/kg) ja SMX (2 μg/kg). SDM realiseerimisvalmis kompostist ei leitud. Kui võrrelda Tallinna ja Tartu reoveesette töötlemise tehnoloogiaid ravimijääkide eemaldamise seisukohalt, on ilmne, et Tallinnas kasutatav anaeroobselt stabiliseeritud sette segamine turbaga on efektiivsem, kui pressitud sette aeroobne stabiliseerimine kompostimisel purustatud puukoorega Tartus. Tartu 12 kuud seisnud kompostist leiti märkimisväärses koguses antibiootikumide jääke, Tallinna kompostis olid need ravimid selleks ajaks praktiliselt lagunenud – sisaldus alla 1 μg/kg. Fluorokinoloonid adsorbeeruvad tugevasti tahkete osakeste külge ega eemaldu sealt kergesti. Adsorptsioon võimaldab seletada fluorokinoloonide erinevaid kontsentratsioone sama päeva reoveesette ja sama kuu kompostiauna proovides, samuti nende kõrgemaid sisaldusi kuus kuud seisnud kompostis võrreldes kaks kuud seisnud kompostiga. Kõige madalama ravimisisaldusega mullast 10 μg/kg akumuleerusid taimede söödavatesse osadesse ainult OFL ja CIP. Kõrgematel ravimikontsentratsioonidel kasvanud taimedest leiti ka teisi antibiootikume: NOR ja SMX alates 100 μg/kg, SDM alates 500 μg/kg. Taimsele toidutoormele ravimijääkide MRL kehtestamise vajadus sõltub ravimite sisaldusest reoveesette kompostis (või sõnnikus). Reoveesette töötlemise täiustatud tehnoloogiad peaksid tagama ravimijääkide sisalduse vähenemise kompostväetises keskkonnale ohutu tasemeni – 1 μg/kg, mis välistaks ühtlasi ka nende akumuleerumise mullast taimedesse. Ravimijääkide akumuleerumine reoveesette kompostiga (või sõnnikuga) väetatud mullast toidutaimedesse vajab täiendavaid uuringuid, mis peaksid kaasama ka põllukatsed. 104 8.7. Ettepanekud • Enne turustamist tuleks reoveesette komposti analüüsida ravimijääkide sisalduse suhtes. • Ravimijääkide sisaldus kompostis ei tohiks ületada 1 μg/kg. • Ravimijääkide sisalduse alandamiseks soovitatud tasemeni peaks komposti töötlemise ja hoiustamise aeg olema turbaga kompostimisel vähemalt aasta, puukoorega kompostimisel vähemalt kaks aastat.

Kirjeldus

Märksõnad

reovesi, ravimijäägid, antibiootikumid, kompost, väetamine, ohutus, taimekasvatus, toidutaimed, toidu saastumine, toidukontroll, Eesti, dissertatsioonid

Viide

URI

http://hdl.handle.net/10492/146

Kollektsioonid

3. Doktoritööd